世界首例神经疾病基因敲入猪在广东诞生(2)

　　团队进而分析，直接把猪的内源性基因改变为突变基因，猪的病理变化应该与病人的病理状态更接近。然而，基因敲入的效率太低，在大动物中很难获得。2013年，随着基因编辑技术（CRISPR/Cas9）被广泛应用于哺乳动物中，在国家科技计划、国家自然科学基金委、国家重大研究计划、广东省科技计划等的大力支持下，他们大胆尝试这一科学设想，李世华着手应用Cas9技术来建立亨廷顿基因敲入猪模型。团队通力合作，利用基因编辑技术（CRISPR/Cas9），将人突变的亨廷顿基因插入到猪的内源性亨廷顿基因的表达框中，即人外显子1中包含150 CAG重复序列精确地插入猪的HTT内源性基因中。

　　能够成功关键还看实验进展，利用成纤维细胞筛选出阳性克隆细胞，这并非一件易事，“单细胞逐个挑出来并进行筛选及鉴定，一定要挑选状态最好的细胞用来胚胎移植”。负责此项实验工作的闫森先后筛选了上千个细胞，从中挑出确定带有突变基因且状态最好的细胞，闫森说，“每天早上7点进入细胞间，看细胞、换液、不停地跟细胞打交道，一抬头已是下午3点。好不容易筛选到的阳性克隆细胞如果状态不好又得重来，只有大量筛选才能获得最优的细胞克隆。很快，实验进入下一步，他们运用体细胞核移植技术进行克隆，成功培育带有突变基因的新生猪。在历经5个月的观察后，亨廷顿猪出现了运动障碍等渐进性发病的表型。下一步就是将稳定表达的基因敲入亨廷顿猪繁殖下去。由于疾病模型猪身体状态不好，在传代过程中更需要悉心的照料。终于在团队的呵护下F1代小猪出生了。为了证明亨廷顿基因敲入猪的病理特征更接近于人类。李世华多次从美国返回国内亲自指导实验，到猪场看小猪的生存环境及生活状态。

　　为人类试药 造福于人类 神经退行性疾病研究领域里程碑式的发现

　　神经疾病基因敲入猪的成功，将推动我国发展出大动物疾病模型的医药研发产业链，促进针对阿尔茨海默病、帕金森症等神经退行性疾病，以及免疫缺陷、肿瘤、代谢性疾病的新药研发进程。同时，该动物模型可用于干细胞治疗等手段的临床前评价，最终造福于人类。

　　从事多年研究亨廷顿病的权威专家、美国加州大学洛杉矶分校杨向东(X. William Yang)教授指出，亨廷顿舞蹈病基因敲入猪的建立是神经退行性疾病研究领域中一个里程碑式的发现，使科学家能更深入了解神经细胞死亡的机制及寻找有效的治疗方法。